افتح القائمة الرئيسية
آلية النسخ العكسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل.

النسخ العكسي-تفاعل البوليميراز المتسلسل (بالإنجليزية: Reverse transcription polymerase chain reaction) واختصارا (RT-PCR) هي تقنية مخبرية تجمع بين النسخ العكسي للرنا إلى دنا ( ويسمى في هذا السياق الدنا المتمم) وبين مضاعفة جزيئات دنا مستهدفة محددة باستخدام تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR).[1] تُستخدم هذه التقنية أساسا لقياس كمية رنا محدد، ويتم ذلك عبر مراقبة تفاعل المضاعفة باستخدام الفلورية وهي تقنية تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). تستخدم توليفة التقنيتين RT-PCR وqPCR بشكل روتيني لدراسة التعبير الجيني وتقدير كمية الرنا الفيروسي في البحوث وفي المخابر الطبية.

أدت العلاقة الوثيقة بين RT-PCR وqPCR إلى استخدام المصطلح qPCR ليقصد به RT-PCR، وهذا الأمر قد يسبب حيرة [2] لأن RT-PCR يمكن أن تستخدم من دون qPCR على سبيل المثال لتمكين الاستنساخ الجزيئي، سَلسَلة أو تحديد عينات الرنا، وبالعكس يمكن استخدام qPCR من دون RT-PCR، على سبيل المثال لتحديد كمية النُسَخ من قطعة محددة من الدنا.

تاريخعدل

منذ ابتكار تقنية لطخة نورثرن سنة 1977، كانت تُستخدم بشكل مكثف لتكميم (تقدير كمية) الرنا رغم نقائصها فهي: (أ) تقنية مستهلكة للوقت، (ب) تتطلب كمية كبيرة للرنا من أجل تحديد التسلسل المطلوب، (ت) تقدير الكمية غير دقيق في عينات الرنا قليلة الكمية.[3][4] ومع اكتشاف الناسخ العكسي أثناء دراسة التضاعف الفيروسي قاد ذلك إلى تطوير تقنية RT-PCR التي أخذت منذ ذلك الوقت مكان لطخة نورثرن في تحديد الرنا وتكميمه.[5]

انتشرت تقنية RT-PCR لتصبح تقنية مرجعية في تحديد ومقارنة مستويات الرنا لعدة أسباب منها: (أ) لا تتطلب عمليات ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل، (ب) يمكنها قياس مجال واسع (< 107 مرة) من الرنا، (ت) توفر فهما وأفكارا في كلا البيانات النوعية والكمية.[6] بسبب بساطتها، تخصصها وحساسيتها، تُستخدَم تقنية RT-PCR في مجموعة متنوعة من التطبيقات: من تجارب بسيطة مثل تحديد كمية خلايا الخميرة في النبيذ إلى استعمالات أكثر تعقيدا كأداة تشخيص لتحديد العوامل المعدية مثل فيروس إنفلونزا الطيور.[7][8]

مراجععدل

  1. ^ Freeman WM، Walker SJ، Vrana KE (January 1999). "Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential". BioTechniques. 26 (1): 112–22, 124–5. PMID 9894600. doi:10.2144/99261rv01. 
  2. ^ Mackay, Ian (2007). Real-time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Norfolk, England: Caister Academic Press. صفحة 440. ISBN 978-1-904455-18-9. 
  3. ^ Alwine JC، Kemp DJ، Stark GR (December 1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5350–4. PMC 431715 . PMID 414220. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. 
  4. ^ Streit S، Michalski CW، Erkan M، Kleeff J، Friess H (2009). "Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues". Nat Protoc. 4 (1): 37–43. PMID 19131955. doi:10.1038/nprot.2008.216. 
  5. ^ Bustin SA (October 2000). "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays". J. Mol. Endocrinol. 25 (2): 169–93. PMID 11013345. doi:10.1677/jme.0.0250169. 
  6. ^ Bustin SA، Benes V، Nolan T، Pfaffl MW (June 2005). "Quantitative real-time RT-PCR--a perspective". J. Mol. Endocrinol. 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . PMID 15956331. doi:10.1677/jme.1.01755. اطلع عليه بتاريخ 06 نوفمبر 2012. 
  7. ^ Hierro N، Esteve-Zarzoso B، González A، Mas A، Guillamón JM (November 2006). "Real-time quantitative PCR (QPCR) and reverse transcription-QPCR for detection and enumeration of total yeasts in wine". Appl. Environ. Microbiol. 72 (11): 7148–55. PMC 1636171 . PMID 17088381. doi:10.1128/AEM.00388-06. 
  8. ^ Slomka MJ، Pavlidis T، Coward VJ، وآخرون. (July 2009). "Validated RealTime reverse transcriptase PCR methods for the diagnosis and pathotyping of Eurasian H7 avian influenza viruses". Influenza Other Respi Viruses. 3 (4): 151–64. PMC 4634683 . PMID 19627372. doi:10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x.